طريقة العالم الشهير (فريدرك سانجر ) لتضاعف المادة الوراثية
تعتمد طريقة (سانجر) على إجراء تضاعف للمادة الوراثية بتوفير إنزيم DNA Polymerase وبادئ مشع Labelled primer وطرز الدى أوكسى نيوكليوتيدات Deoxy nucleotide triphosphate الأربعة ويشترط أن يكون أى من البادئ أو الدى أوكسى نيوكليوتيدات مشعة حتى يمكن متابعة الجزيئات كما سنرى فيما بعد . وحجر الزاوية فى هذه التقنية هو أن يضاف قدراً ضئيلاً من مركبات الداى دى أوكسى نيوكليوتيدات 2,3- dideoxy nucleotides وهى :
Dideoxy thy midline triphosphate (ddTTP)
Didexoy cytidine triphosphate (ddCTP)
Didexy adenosine triphosphate (ddATP)
Dideoxy guanosine triphosphate (ddGTP)
وميزة هذه المركبات هى عدم وجود مجموعة (OH) فى ذرة الكربون رقم (3) فى جزئ السكر الخاص بها فإذا ما ارتبط أى من هذه الجزيئات فى شريط DNA فإنه يتعذر بعد ذلك أرتباط أى دلى دى أوكسى نيوكليوتيدات لاحق ، وبذلك تقف عملية نمو الشريط DNA عند هذا الحد .
وغنى عن القول ان هذه المركبات الأربعة الموضح أسمائها فيما سبق يتم إدخال أى منها فى الشريط الجديد النامى لحمض DNA بعد فصل مجموعتى فوسفات من كل منها كما فى الحالة العادية .
* وفيما يلى موجز بالخطوات الأساسية للكشف عن تتابع الجزيئات المكونه للمادة الوراثية بطريقة سانجر DNA- Sequencing :
. باستخدام أحد إنزيمات القصر A restriction enzyme يتم تقطيع جزئى DNA إلى قطع Fragmentsتتميز بأن طرف واحد لها جميعا يحمل ففى تتابعات الدى أوكسى نيوكليوتيدات ولكن هذه القطع غير متساوية الطول بالطبع .
2. تفصل هذه القطع بعضها عن بعض حسب طول كل منها عن طريق الفصل الكهربائى باستخدام ألواح الجيلاتين .
3. تستخلص قطع حمض DNA من شرائط الجيلاتين DNA- elution .
4. تجرى مضاعفة amplification كل مجموعة من قطع DNA على حدة باستخدام تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) وذلك فى وجود بادئ Primer والدى أوكسى نيوكليوتيدات الأربعة وكمية قليلة من أحد الداى دى أوكسى نيوكليوتيدات (وليكن ddATP ) .
5. ومن الجدير بالذكر أن البادئ سيحتوى على مجموع (OH) عند ذرة الكربون رقم (3) لجزئى السكر مما يساعد على أرتباط أحد جزيئات النيوكليوتيدات المزود بها التفاعل – وبذلك سيبدأ تخليق شريط جديد أمام كل شريط قديم وسيتوالى ترتيب النيوكليوتيدات الجديدة فى بناء الأشرطة الجديدة ولكن عملية بناء أى شريط ستقف إذا أخذ جزئ ( داى نيوكليوتيد ) فى بناء الشريط الجديد وحدوث هذا الاحتمال الأخير يتم عشوائيا ويؤدى ذلك إلى أن الجزيئات الجديدة ستكون متفاوتة فى أطوالها ولكن كل منها ينتهى بالداى دى أوكسى نيوكليوتيد ( ddATP) ويبدأ عند الموقع نفسه .
6. تكرر الخطوة الأخيرة ولكن بوضع كمية قليلة من داى دى أوكسى نيوكليوتيد أخر وليكن ( ddTTP ) وعندئذ فإن الأشرطة الجديدة ستتفاوت أطوالها أيضا وينتهى كل منها بالداى دى أوكسى نيوكليوتيد ( ddTTP ) .
7. تكرر مرة ثالثة ورابعة باستخدام الداى دى أوكسى نيوكليوتيد ddCTP ثم الداى أوكسى نيوكليوتيد ddGTP .
8. تؤخذ قطع الـ DNA الناتجة عن عمليات المضاعفة الأربع ويجرى لها فصل كهربائى باستخدام ألواح الجيلاتين ، وهذا يتم بعمل أربع حفر wells متجاورة فى لوح الجيلاتين – ليوضع فى كل حفرة قطع DNA التى تنتهى شرائطها بأحد الداى دى أوكسى نيوكليوتيدات .. ويمثل الجلاتين الممتد أمام كل حفرة ما يسمى حارة Lane .
يؤدى الفصل الكهربى إلى انفصال قطع الحمض النووى فى شرائط فى كل حارة فى الجيلاتين حسب أطوالها وتعبر شرائط كل حارة عن تواجد أحد النيوكليوتيدات ويمكن عن طريق تتبع النيوكليوتيدات فى الحارات الأربع للجيلاتين معرفة ( قراءة ) ترتيب النيوكليوتيدات المكونه للقطعة من جزئ DNA المستخدمة .
وتجدر الإشارة إلى أن ماكسام وجلبرت A. Maxam &W. Gilbert من جامعة هارفارد كانا قد ابتكرا طريقة أخرى للكشف عن تتابع النيولكيوتيدات فى الحمض النووى DNA ونشرا بحثهما فى العدد 74 لعام 1977 من مجلة Proc National Acad Sci وبصفة عامة تعتبر الطريقتان سالفتا الذكر مجهدتان وتستغرقان وقتا طويلاً . وقد استطاعت الشركات العلمية المتخصصة ابتكار أجهزة تقوم آليا Automated بكشف التتابعات فى حمض DNA بكفاءة وسرعة وقد تم استخدام هذا الأسلوب مرة فى عام 1986 وقد ابتكر حديثا جهاز يعرف باسم lionization – laser desorption – Assisted – Matrix MALDI-) time – of – flight mass spectrometry يقوم بتبخير قطع DNA ، وعلى أساس الوقت الذى تستغرقه مكوناتها إلى موقع كشاف detector ملحق بالجهاز – وهذا يعتمد على كتلة كل منها – يمكن تحديد التتابعات وتعمل شركة Sequenom فى (سان ديجو) على توظيف هذا الجهاز فى تشخيص الأمراض الوراثية.
– وقد حمل لنا عدد 16 تشرين الأول (1998) من مجلة Science استشرافا للمستقبل فى ابتكار وسيلة لتصغير miniaturization مستلزمات تقنية طريقة الكشف عن تتابع الجزيئات فى المادة الوراثية ليصبح فى الإمكان استخدام رقائق Chips تحوى السوائل اللازمة بقدر ضئيل جداً micro fluides ولن يزيد حجم الرقاقة التى تقوم بمقام معمل كامل – عن حجم راحة اليد .
– ومن الجدير بالذكر أن العالم البيولوجى (هود) Leroy Hood وزملائه فى معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ( Caltech ) كانوا قد ابتكروا تكنولوجيا تعيين تتابعات الجزيئات فى حمض DNA أليا وذلك فى الثمانينيات وفى هذه الماكينة تعطى كل من الدى أوكسى نيوكليوتيدات الأربعة لونا يميزها وقد قامت مؤسسة PE Corp فيما بعد بصناعة الماكينة وتسويقها – وتتعاون هذه المؤسسة – ورئيسها هنابلر Michael Hunapiller مع مؤسسة سيلير Celera ورئيسها كريج فنتر craig venter معاً من أجل كشف تتابعات الجينوم البشرى وعدد أخر من الكائنات .
تطبيقات تفاعل البلمرة المتسلسل ( PCR )
البصمة الوراثية
قبل ان نتناول بالشرح هذه التقنية أود أن أذكر أن مادة DNA تتكون من جزيئات متتابعة تسمى دى أوكسى نيوكليوتيدات ويتكون كل جين يحمل صفه وراثية من عدد من هذه الوحدات .
– وقد اتضح للعلماء فى عام 1977 أن الجينات فى الكائنات حقيقيات النواة Eukaryotes ليست متصلة فى استمرارية ، فليست كل المناطق يرمز فيها تتابع الدى أوكسى نيوكليوتيدات إلى صفات وراثية معينة ، وهذه المناطق البيئية من جزئ DNA غير معلومة الوظيفة .
وما يهمنا هنا أن هناك أجزاء من تلك المناطق غير معلومة الوظيفة تكون تسلسل معين من جزيئات الدى أوكسى نيوكليوتيدات التى يتراوح عددها عادة بين 7-100 ويطلق على هذا التسلسل اسم التابع الصغير” minisatellite” ويتكرر هذا التسلسل ليكون قطع مختلفة الأطوال تكرر فى المادة الوراثية “الجينوم” للفرد ومن المهم أن أذكر أيضا أن أطوال هذه القطع وعدد مرات تكرارها يختلف من فرد لأخر ، ولذلك توصف التوابع الصغيرة minisatellite بأنها تكرارات متتابعة متنوعة الأعداد variable number of tandem repeat(VNTR)
وهذه الخاصية هى التى تعتمد عليها تقنية البصمة الوراثية التى تميز كل فرد وقد قدر أن الجينوم البشرى يحتوى على 100.000 من هذه المواقع وتعتمد أسس تقنية البصمة الوراثية على إنجازات معينة فى مجال البيولوجيا الجزيئية هى :
1- أنه يمكن قطع المادة الوراثية إلى أجزاء صغيرة ، وأن مواقع القطع تعتمد على نوع الإنزيم المستخدم فى القطع فهناك إنزيمات تسمى ” إنزيمات القصر ” لكل منها موقع معين يقوم عنده بعملية تقطيع المادة الوراثية .
2- توصلوا العلماء إلى تقنية معملية تسمى اختصاراُ PCR يمكن بها مضاعفة المادة الوراثية لإجراء التجارب عليها ويمكن اقتصار عملية التضاعف على أجزاء محددة من المادة الوراثية وفقا لما يضيفه الباحث من مادة يطلق عليها البادئ Primer تتجانس مع الأجزاء المراد مضاعفتها .
3- أن أجزاء المادة الوراثية إذا ما وضعت على لوح جيلاتينى خاص – متصل بالكهرباء من ناحيتين وذلك عند القطب السالب فإن قطع المادة الوراثية ستتحرك داخل اللوح الجيلاتينى من عند القطب السالب فى اتجاه القطب الموجب ، وتختلف المسافة التى يقطعها كل جزء من المادة الوراثية حسب حجم . فالقطعة الأكبر حجما تقطع مسافه أقل ، بينما القطعة الأصغر حجما تجرى فى الجيلاتين مسافة أطول والمهم هنا أن قطع المادة الوراثية ستنفصل بعضها عن بعض داخل لوح الجيلاتين وتعرف هذه التقنية باسم الفصل الكهربى الجيلاتينى Gel electrophoresis
ويتلخص إجراء عمل البصمة الوراثية فى الخطوات الأتية
• تقطع جزيئات حمض DNA بإنزيم قصر Restriction enzyme .
• تجرى عملية مضاعفة amplification للقطع من جزئى DNA المكونة من توابع صغيرة minisatellites بإجراء تقنية PCR باستخدام بوادئ تناسب التتابعات التى تحد التوابع الصغيرة Flanking – Sequence Primers ، وبهذا يصبح لدينا كمية كبيرة من كل من هذه التوابع المميزة من المادة الوراثية .
• يجرى فصل كهربى جيلاتينى لقطع المادة الوراثية DNA التى تم مضاعفتها فى الخطوة السابقة ، وهى بالطبع قاصرة على قطع التوابع الصغيرة ، والفصل الكهربى سيعمل على فصل هذه القطع بعضها عن بعض فى الجيلاتين على حسب أطوالها – وسيكون نمط توزيعها خاص ومميز للفرد .
وتستخدم طريقة “التقاط سزرن” “Southern blotting فى تنفيذ تقنية “البصمة الوراثية “
ويمكن تلخيص خطوات العمل كما يلى :
• تقطع جزيئات حمض DNA باستخدام إنزيم قصر وتجرى مضاعفة لقطع DNA الناتجة باستخدام تقنية PCR وبالطبع فإن minisatellites ستوجد فقط فى بعض قطع الـ DNA .
• يجرى فصل كهربائى بالجيلاتين لقطع حمض DNA فتتوزع هذه القطع فى الجيلاتين حسب أطوالها .
• يتم فصل شريطى جزئ حمض DNA عن بعضهما فى لوح الجيلاتين وذلك باستخدام مادة قلوية .
• باستخدام لوح من نيترات السليلوز Cellulose nitrate filter التقاط blotting شرائط حمض DNA من على لوح الجيلاتين وذلك بطريقة (سزرن) ويشبه ذلك بما تلتقطه قطعة ورق النشاف من الحبر من على الورق .
• تعامل شرائط حمض DNA بمجسات DNA مشعة labelled DNA probes تحمل القواعد المكملة لشرائط حمض DNAالخاصة بـ minisatellites الموجودة على لوح نيترات السليلوز وبالطبع فإن هذه المجسات لن ترتبط بكل قطع حمض DNA ولكنهاسترتبط فقط بشرائط الـ minisatellites وبذلك تصبح مواقع هذه الـ minisatellites مشعة ويمكن تحديد مواقعها بأفلام التصوير الحساسة لأشعة (X)
و من الجدير بالذكر أن البصمة الوراثية تستخدم في قضايا النسب الشرعية
مكتبة الجينوم (Genomic library)
يقصد بمكتبة الجينوم تقطيع الجينوم ( أى حمض DNA فى الكروموسومات ) إلى أجزاء تم تحميلها على فيروس أو بلازميد أو كروموسوم اصطناعى للخميرة حتى يمكن اللجوء إلى أى من هذه القطع عند القيام بالبحوث ويلاحظ هذا أن المكتبات التى يتم الحصول عليها من الخلايا المختلفة بالجسم تكون متماثلة بالطبع ويتم تقطيع الجينوم باستخدام أحد إنزيمات القصر ، وإذا أريد الحصول على قطع صغيرة الحجم استخدم أحد إنزيمات القصر التى تقوم بالقطع عند نيوكليوتيدات أربعة معينة Tetranucteotide مثل الإنزيم Haelll الذى يقوم بالتقطيع عند التتابع GGCC أو الإنزيم Sau3A الذى يقوم بالتقطيع عند التتابع GATC تفصل بعد ذلك قطع الجينوم بعضها عن بعض باستخدام الفصل الكهربى الجيلاتينى gel electrophrosis ثم تحمل القطع على فيروس لامدا Lambda virus وفى حالة الجينوم البشرى ( 3 × 610 كيلو بيز – تقطع إلى حوالى 200.000 جزء ) يستخدم حوالى نصف مليون فيروس لضمان تحميل جميع أجزاء الجينوم وعند الاحتياج إلى جزء من الجينوم يتم كلونة الجينوم عن طريق إكثار الفيروس ثم استخدام مجس Probe للحصول من الجينوم على الجزء المطلوب التعامل معه .
ويلاحظ أن الفيروس أو البلازميد يمكن أن يحمل قطعة من الجينوم طولها يزيد عن 20 – 25 كيلو بيز ، ولذا فإن كروموسوم الخميرة الاصطناعى ( YAC ) Yeast Artificial chromosome يستخدم مع القطع الكبيرة حيث يمكنه حمل قطع يتراوح حجمها من 100 – 1000 كيلو بيز (مليون من أزواج القواعد) وفى هذه الحالة يستخدم إنزيم قصر يقوم بالقطع عند تتابعات يصل عددها إلى ثمانية مثل إنزيم Not I الذى يقطع عند التتابعات GCGGCCGC
مكتبة حمض DNA المكمل ( cDNA Library )
“Complementary DNA Library “
الغرض من تجهيز هذه المكتبة بصفة عامة هو نفس الهدف الذى من أجله تعد مكتبة الجينوم ، ولكن مكتبة حمض ( cDNA ) تجهيز بطريقة مختلفة عنها فى اعتبارات معينة .
وتبدأ طريقة العمل هنا باستخلاص حمض m-RNA ناضج أى بدون إنترونات introns من خلايا معينة فى النسيج ، ثم يتم بناء شريط DNA أمام شريط m-RNA باستخدام إنزيم النسخ العكسى reverse transcriptase وذلك باستخدام بادئ يتكون من عدد من القاعدة ( T ) ليتقابل مع طرف جزئى m-RNA الذى يتميز باحتوائه على ذيل من القواعد ( A ) وهى المنطقة المعروفة باسم poly aden ylic tail ، ويلاحظ أن الطرف ( 3′ ) لجزئى c DNA المخلق أمام m- RNA يكون أنشوطه ( بنسبه شعر ) hairpin loop ويعمل هذا الجزء كبادئ primer لبناء شريط DNA مقابل ثم يتم التخلص من هذه الأنشوطه باستخدام إنزيم – وبذا يصل بناء cDNA إلى صورته النهائية ليستخدم فى بناء مكتبة cDNA عن طريق التحميل والكلونه كما فى حالة مكتبة الجينوم .
وتتميز هذه المكتبة عن مكتبة الجينوم بما يلى :
– أن المكتبة تحتوى على إكسونات exons فقط وهى الأجزاء المكونة للجينات وبالتالى فالجين يوجد بطريقة غير متقطعة ، وبالتالى فإن حجم المكتبه هنا يكون أقل ولكن ذو فعالية أكبر .
– أن المكتبة هنا خاصة بنشاط الخلايا التى أخذ منها ( m- RNA ) فهى لا تحمل الجينوم كله ، وذلك يسهل الدراسات الخاصة بهذا الطراز من الخلايا – ويفيد ذلك فى دراسة تعبير الجينات فى الأمراض الوراثية بخلايا معينة .
– فى هذه الطريقة تجهيز مكتبة لكل طراز من الخلايا .
– ان هذه المكتبة تسمح بتتبع أنشطة طراز معين من الخلايا عبر مراحل تكوينية مختلفة والتى تمر بها هذه الخلايا .
– يمكن استخدام أجزاء من مكتبة c- DNA لإنتاج بروتين معين عن طريق نقلها الى البكتريا أما نقل أجزاء من مكتبة الجينوم إلى البكتريا لهذا الغرض فهو عديم الجدوى حيث أن البكتريا تفتقد الى ألية فصل الإنترونات وربط الإكسونات
مميزات و عيوب تفاعل البلمرة المتسلسل(PCR)
إن تفاعل البلمرة المتسلسل يشمل العديد من التطبيقات واسعة المجال و التى تعتمد اساسا على ثلاث ميزات أساسيه له وهى:-
1. سرعة وسهولة إستخدامه:-
فإستنساخ ال (DNA)بواسطة تفاعل البلمرة المتسلسل يطبق خلال ساعات قليلة فهو يتكون من 30 دوره تتضمن تفكيك و تكوين وإعادة تركيب شريط جديد من (DNA)فى خلال دوره واحده مدتها من 3 إلى 5 دقائق .
2. حساسيته:-
تفاعل البلمره المتسلسل قادر على مضاعفة التتابعات من كميات صغيرة من ال(DNA) المستهدف مما له تطبيقات عديده كما فى الطب الشرعى عندما تحتوى العينه على كميه ضئيله من الخلايا .
3. قوته:-
تفاعل البلمرة المتسلسل يسمح بمضاعفة تتابع بعينه من (DNA) والذى يمكن إحضاره من وسط يصعب فيه عزل ال(DNA)التقليدى .
• عيوبه
1. الحاجة إلى معرفة تتابع الجين المستهدف
2. محدودية الكميات المنتجة من ال(DNA).
3. عدم دقة النسخ
حيث أن إنزيم (Taq polymerase)ليس له القدرة على تصحيح الاخطاء (proof reading).
منقول